一、前言

   面部創(chuàng)傷（例如嚴(yán)重?zé)齻┗蚰[瘤切除術(shù)后耳鼻的重建可能具有挑戰(zhàn)性，特別是當(dāng)軟骨框架受損時(shí)。然后，自體軟骨移植物通常與皮瓣聯(lián)合使用，例如鼻子的前額皮瓣或耳朵的脾氣膜筋膜瓣。然而，軟骨移植物的供體部位可能有限，并且總是存在一定量的供體部位發(fā)病率。1特別是，軟骨結(jié)構(gòu)（如耳朵或鼻翼）的重建仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)，因?yàn)樗鼈儚?fù)雜的三維形狀和對軟骨特征的高要求。2軟骨結(jié)構(gòu)的彈性特性不僅與臨床結(jié)果相關(guān)，而且與更基礎(chǔ)的研究有關(guān)。

   從臨床醫(yī)生的角度來看，人們傾向于關(guān)注移植組織的大規(guī)模力學(xué)。為了確定這一點(diǎn)，通常執(zhí)行粗機(jī)械測試。例如，由Britt等人測量耳軟骨和組織工程軟骨的拉伸性能。3通過將增量拉伸載荷施加到啞鈴形的軟骨切口上。羅伊等人提出了另一種方法4誰比較了安裝在機(jī)械光譜儀中的3點(diǎn)彎曲裝置中的天然，工程耳骨和肋軟骨。壓縮載荷實(shí)驗(yàn)通常由受限壓縮或壓痕組成。5，6拉伸或壓縮測量都有其優(yōu)點(diǎn)和局限性。7然而，它們都有一個(gè)關(guān)鍵的局限性，即上述方法僅提供總解剖學(xué)尺度上的信息。目前，許多研究小組正在探索不同面部組織的再生醫(yī)學(xué)和組織工程的可能性。例如，組織工程耳軟骨可能是克服組織移植問題的一種選擇，例如供體部位的發(fā)病率。8從手術(shù)的角度來看，上述機(jī)械測試很重要，因?yàn)槲覀冃枰銐驈?qiáng)度的材料，以便在覆蓋肌肉和皮膚時(shí)保持形狀。然而，為了設(shè)計(jì)用于（軟骨）組織再生的適當(dāng)支架，關(guān)于細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）水平的更詳細(xì)的機(jī)械信息至關(guān)重要。

   組織工程的關(guān)鍵是為再生細(xì)胞保持其表型并形成新組織創(chuàng)造適當(dāng)?shù)沫h(huán)境。ECM是組織形式和功能的基礎(chǔ)。9耳軟骨ECM由膠原束，彈性蛋白纖維和糖胺聚糖的復(fù)雜混合物組成，每種都對組織的機(jī)械性能具有特定的影響。越來越多的證據(jù)表明，細(xì)胞非常容易受到其環(huán)境的機(jī)械特性的影響。10，11因此，支架的剛度對細(xì)胞行為和命運(yùn)有重要影響。12–14從而在結(jié)構(gòu)作為一個(gè)整體的機(jī)械特性上。為了形成正確的組織，支架必須與受損組織的原始硬度緊密匹配。因此，關(guān)于微尺度ECM生物力學(xué)的特定空間信息對于臨床成功至關(guān)重要;隨著時(shí)間的推移，我們需要能夠在細(xì)胞（微觀）水平上監(jiān)測組織工程結(jié)構(gòu)的機(jī)械性能。再生軟骨將隨著新的ECM組件和結(jié)構(gòu)的發(fā)展而發(fā)生機(jī)械變化，支架退化并被替換。因此，在原子力顯微鏡（AFM）和大機(jī)械測試之間，在微觀尺度上對組織工程和移植結(jié)構(gòu)的質(zhì)量評估對于再生醫(yī)學(xué)的未來臨床實(shí)施至關(guān)重要。為了解決這個(gè)問題，我們測試了一種商用壓痕器件（Piuma Nanoindenter;Optics11，荷蘭阿姆斯特丹）能夠在適當(dāng)?shù)奈⒊叨壬线M(jìn)行測量。該系統(tǒng)基于套圈頂懸臂探頭12其在生命科學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用已經(jīng)在不同領(lǐng)域得到證明。13，14在這里，我們擴(kuò)展了這一系列研究，以評估其使用反向組織工程模型監(jiān)測耳軟骨再生隨時(shí)間變化的適用性。

   軟骨對機(jī)械力的響應(yīng)受2種機(jī)制的影響：流體動(dòng)力學(xué)和ECM結(jié)構(gòu)本身的變化。5糖胺聚糖通過吸引水分和使?jié)B透壓積聚而形成ECM的重要組成部分。15彈性蛋白纖維的分布和機(jī)械功能是耳軟骨所有的。16它們對耳朵特定機(jī)械性能的貢獻(xiàn)使得在植入工程軟骨時(shí)，它們已經(jīng)充分形成至關(guān)重要。相反，去除這些成分中的任何一個(gè)都會(huì)定性地影響軟骨。我們設(shè)計(jì)了一個(gè)耳軟骨組織模型，以反向方式模擬支架隨時(shí)間推移的發(fā)展。通過對這些組分中的任何一種進(jìn)行特定的酶降解，我們創(chuàng)建了一個(gè)客觀的研究模型，以測試壓頭是否能夠在非破壞性物質(zhì)中以適當(dāng)?shù)某叨葴?zhǔn)確測量ECM的各種結(jié)構(gòu)組分之間的差異。隨著人們的廣泛關(guān)注和最近的進(jìn)展，例如用于組織再生的3維生物打印機(jī)，從頭到尾監(jiān)測發(fā)育組織的機(jī)械質(zhì)量的能力對于在臨床上實(shí)施這些新型組織工程方法至關(guān)重要。

二、方法

   （1）樣品制備

   耳軟骨是在附近屠宰場從2至3歲的荷蘭奶山羊單側(cè)獲得的。耳朵（n = 9）被運(yùn)送到冰上的實(shí)驗(yàn)室，在那里±2厘米2從每個(gè)耳朵的基部取出大小大小的軟骨樣本。將樣品進(jìn)一步橫向分成三個(gè)5mm高的部分，并用一層薄薄的氰基丙烯酸酯（超級）膠水固定在玻璃顯微鏡載玻片上。新鮮測量每個(gè)耳樣品的橫向平面，然后將相同的樣品在37°C的磷酸鹽緩沖鹽水中孵育，以便在24和48小時(shí)測量。其他2個(gè)樣品以類似的孵育方式進(jìn)行，但分別加入1%的透明質(zhì)酸酶或彈性蛋白酶溶液（均來自密蘇里州圣路易斯的Sigma Aldrich）以除去糖胺聚糖或彈性蛋白。

  （2）縮進(jìn)設(shè)置

      使用商用納米壓痕儀（Piuma;光學(xué)11）。該儀器能夠通過壓痕局部測定樣品在空氣和液體環(huán)境中的機(jī)械性能。它采用套圈頂懸臂探頭8，22施加負(fù)載，同時(shí)使用基于光纖的讀數(shù)測量壓痕深度。由此產(chǎn)生的應(yīng)力-應(yīng)變曲線（圖.（圖1A）1A）使用Oliver和Pharr描述的模型進(jìn)行分析17，23用于球形壓頭，以確定有效的楊氏模量 （E*）。使用合適的探頭進(jìn)行設(shè)置，能夠施加0.1至7.5 μN(yùn)的力。在每個(gè)系列實(shí)驗(yàn)之前，通過縮進(jìn)剛性表面并將懸臂彎曲等同于探頭位移來執(zhí)行懸臂彎曲校準(zhǔn)。在許多方面，這種設(shè)置可與AFM相媲美。然而，與大多數(shù)通常在亞細(xì)胞（納米）范圍內(nèi)起作用的AFM相反，這種設(shè)置也能夠在細(xì)胞和組織范圍內(nèi)發(fā)揮作用。

圖 1.

A、軟骨測量的壓痕曲線。切線（紅色）表示用于確定有效楊氏模量的卸載曲線的斜率。B，壓頭的圖形細(xì)節(jié)：球形成壓頭（? = 78μm）。

   （3）壓痕探頭

   使用直徑為78μm，剛度為80 N /m的球形壓頭來接觸面積，并將壓痕過程中的組織損傷降至（圖.（圖1B）。1B）.為了進(jìn)一步增加與的接觸面積，通過使用設(shè)置的全壓痕深度（20μm）使壓痕深度。

   （4）縮進(jìn)協(xié)議

    壓痕協(xié)議經(jīng)過精心優(yōu)化，以最大限度地減少影響測量的粘彈性效應(yīng)。使用2秒加載周期，2秒保持期和4秒卸載周期，可以精確確定曲線角系數(shù)。

   （5）壓痕實(shí)驗(yàn)

   在實(shí)驗(yàn)過程中將樣品浸沒在磷酸鹽緩沖鹽水中，以防止脫水并最大限度地減少壓頭和組織表面之間的粘合力。在準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)（未顯示數(shù)據(jù)）中，沒有發(fā)現(xiàn)膠水對負(fù)載的不利影響。每個(gè)樣品都沿著軟骨的中心線縮進(jìn)，以避免邊緣效應(yīng)。為了平均手術(shù)切口和組織不均勻性可能的表面粗糙度效應(yīng)，將每個(gè)樣品縮進(jìn)在相距300μm的9個(gè)位置以獲得平均數(shù)據(jù)。

   （6）組織學(xué)

   將三個(gè)樣品固定在4%福爾馬林中，并嵌入石蠟中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行切片。載玻片用Alcian藍(lán)色或Lawson染色分別描繪糖胺聚糖或彈性蛋白纖維，并拍攝顯微圖像（徠卡DM4000B / DC500;韋茨拉爾， 德國;放大倍率，200×）。

   （7）統(tǒng)計(jì)分析

   在降解實(shí)驗(yàn)之前，通過對3個(gè)不同耳軟骨樣品的單一位置進(jìn)行10次連續(xù)測量的類內(nèi)相關(guān)系數(shù)（雙向隨機(jī)效應(yīng)）來確定壓痕的再現(xiàn)性。使用類間相關(guān)系數(shù)（ICC）計(jì)算降解實(shí)驗(yàn)中單個(gè)樣品上單獨(dú)壓痕之間的變異性?；谶@些結(jié)果，通過方差檢驗(yàn)的單變量分析確定了有效楊氏模量的差異。所有分析均使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件版本22進(jìn)行。P值小于0.05被認(rèn)為是顯著的。

三、結(jié)果

    這些實(shí)驗(yàn)的一個(gè)重要方面是壓痕協(xié)議的定義，以確保粘彈性效應(yīng)既不影響也不影響卸載曲線。粘彈性效應(yīng)表現(xiàn)為壓痕過程中能量的時(shí)間依賴性耗散。18這在應(yīng)力-應(yīng)變曲線中通過加載曲線和卸載曲線之間的面積進(jìn)行可視化。奧利弗和法爾描述的模型17利用卸載曲線的斜率來確定有效的楊氏模量（圖.（圖 1A）。1為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，在加載后引入保持期，以使樣品有足夠的時(shí)間在卸載樣品之前使能量消散。除此之外，卸載速度保持足夠慢，以使樣品能夠重新調(diào)整到不斷減小的負(fù)載，因?yàn)檠舆t樣品響應(yīng)的累積會(huì)對卸載曲線產(chǎn)生不利影響。準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)（數(shù)據(jù)未顯示）表明，2秒負(fù)載，2秒保持和4秒卸載周期足以防止粘彈性效應(yīng)顯著影響卸載曲線（負(fù)載值線性下降，從而可以精確確定曲線角度系數(shù);圖）。圖1A）。1A）.雖然樣品在壓痕深度方面在保持期后仍表現(xiàn)出松弛，但較長的保持期并不表明在*壓痕期間能量耗散的顯著變化。探針直徑的選擇基于組織學(xué)切片，顯示平均山羊耳狀軟骨細(xì)胞直徑約為10μm，而含有2或3個(gè)軟骨細(xì)胞的更橢圓形的腔隙最長測量在40μm左右（圖。（圖 2）。2).因此，78μm被認(rèn)為足以測量平均ECM值，同時(shí)仍然足夠精細(xì)以提供詳細(xì)信息。文獻(xiàn)中的力學(xué)測試顯示，耳軟骨的楊氏模量范圍為0.8至8 MPa。16以此為參考，選擇了剛度為80 N / m的懸臂，以確保探頭的大部分行程將轉(zhuǎn)化為壓痕深度而不是懸臂彎曲，從而產(chǎn)生7至15μm之間的壓痕深度。

圖 2.

山羊耳朵軟骨橫截面的微觀明場濾波圖像（100×）。平均空隙大小約為40μm（紅色橢圓）。

通過在3個(gè)不同樣品上的單個(gè)點(diǎn)重復(fù)壓痕來確認(rèn)壓痕系統(tǒng)的可重復(fù)性，ICC為0.99。組織學(xué)證實(shí)了糖胺聚糖和彈性蛋白從進(jìn)行壓痕實(shí)驗(yàn)的外圍區(qū)域的處理組織樣品中降解（圖。（圖3）3).

圖 3.

3 個(gè)隨機(jī)標(biāo)本（山羊 1、4 和 7）的組織學(xué)圖像 （200×）在 48 小時(shí)處染色糖胺聚糖（阿爾西安藍(lán)染色，左部分）和彈性蛋白（勞森染色，右部分）。所有圖像均從橫向樣品側(cè)拍攝，其中進(jìn)行壓痕（每張圖像的頂部），并且最大限度地暴露于酶。兩組對照樣品均顯示強(qiáng)糖胺聚糖或彈性蛋白染色。用透明質(zhì)酸酶或彈性蛋白酶處理的樣品顯示出污漬強(qiáng)度降低，特別是在虛線框所描繪的橫向（縮進(jìn)）區(qū)域。酶滲透和隨后的降解都綽綽有余，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過最大壓痕測量深度（>20μm）。

每個(gè)樣品的不同測量結(jié)果具有良好的再現(xiàn)性，ICC平均值為0.9（0.81-0.98）。發(fā)現(xiàn)耳軟骨有效楊氏模量的本地值為5.2 MPa（±0.7）。透明質(zhì)酸酶治療24和48小時(shí)后，這些值分別降至2.2 MPa（±0.6）和2.0 MPa（±0.3）。特別是在彈性蛋白酶組中，個(gè)體差異差異很大，24小時(shí)時(shí)平均有效楊氏模量為4.2 MPa（±0.62），48小時(shí)后平均有效楊氏模量為3.0 MPa（±0.44）（圖。（圖 4）。4).對照組的加班時(shí)間也略有下降，可能是由于自溶過程，但48小時(shí)后所有治療組之間均觀察到穩(wěn)定且顯著的差異（P <0.001）（圖5）5).

圖 4.

Young在24小時(shí)（左）和48小時(shí)（右）下每組不同樣品的模量。Co，控制;Ela，彈性蛋白酶處理組;Hya，透明質(zhì)酸酶治療組。

圖 5.

24小時(shí)和48小時(shí)降解后樣品組的平均楊氏模量（**P <0.001）。對照組在24小時(shí)后顯示初始僵硬喪失，但在48小時(shí)時(shí)沒有進(jìn)一步下降。彈性蛋白酶處理組（Ela）與透明質(zhì)酸酶處理組（Hya）不同，在酶暴露24小時(shí)后沒有顯示出明顯的僵硬損失。在48小時(shí)時(shí)，與對照組相比，所有治療組的僵硬均顯著降低。

四、討論

    當(dāng)臨床醫(yī)生想到組織工程時(shí)，他們往往傾向于只關(guān)注總機(jī)械性能的最終結(jié)果，因?yàn)閺呐R床角度來看，這一方面對手術(shù)成功至關(guān)重要。然而，現(xiàn)在人們越來越認(rèn)識(shí)到，許多組織工程植入物由于細(xì)胞的異常行為導(dǎo)致鈣化或變形和再吸收而長期失敗。19優(yōu)化細(xì)胞將遇到的生物力學(xué)環(huán)境可能是指導(dǎo)細(xì)胞分化和基質(zhì)生產(chǎn)質(zhì)量的關(guān)鍵。測量Young組織和支架模量的細(xì)微差異的能力對于正確微調(diào)細(xì)胞生物力學(xué)微環(huán)境至關(guān)重要。在這項(xiàng)研究中，我們研究了一種能夠在細(xì)胞水平上測量組織硬度的新工具，該工具不僅可以對發(fā)育組織和構(gòu)建體的最終特征進(jìn)行無損評估，還可以對發(fā)育中的組織和構(gòu)建體的起始條件和過程質(zhì)量進(jìn)行無損評估，從而促進(jìn)新型，有效的組織工程方法的開發(fā)。

    我們選擇了“反向組織工程模型"，使用山羊耳朵軟骨作為新鮮材料的一致來源，以證明這項(xiàng)新技術(shù)在測量各種組合物中的組織彈性的適用性。為了探索我們的設(shè)置的適用性和靈敏度，以檢測組織（再）生成過程中組織（再）生成過程中ECM質(zhì)量和組成的細(xì)微差異，以組織剛度為結(jié)果參數(shù)，我們用不同的降解酶處理成熟的彈性軟骨。彈性蛋白或糖胺聚糖的去除導(dǎo)致彈性的顯著普遍降低。然而，彈性蛋白酶消化組的巨大差異令人驚訝。史密斯等人20已經(jīng)注意到，它們在椎間盤環(huán)纖維中酶促降解彈性纖維的廣泛方案不是絕對的。特別是在彈性蛋白酶組中，他們報(bào)告了高變異性。他們進(jìn)一步提出，彈性纖維的降解會(huì)導(dǎo)致膠原結(jié)構(gòu)的分離和變形。這可以解釋為什么我們在彈性蛋白酶組中發(fā)現(xiàn)了如此大的品種;換句話說，這可能是由于彈性蛋白濃度的變化和隨后動(dòng)物之間的降解以及剩余膠原基質(zhì)的重排。后者也可以解釋一些樣品的彈性最初略有增加。在一項(xiàng)關(guān)于彈性蛋白酶對豬肉色動(dòng)脈壁的影響的研究中也觀察到了這種效應(yīng)。21彈性蛋白酶降解與動(dòng)脈壁腫大有關(guān)，但與硬化或軟化無關(guān)。彈性蛋白纖維改變后ECM的結(jié)構(gòu)變化也被提出是耳朵隨著年齡增長而增大的原因。22

    總之，確定（亞）細(xì)胞水平上的機(jī)械性質(zhì)對于深入了解細(xì)胞外力學(xué)的優(yōu)化至關(guān)重要。我們使用的光機(jī)械傳感器系統(tǒng)提供了一種快速可靠的方法來測量該水平上的軟骨ECM變化。目前，我們正在探索將壓痕系統(tǒng)與光學(xué)相干斷層掃描相結(jié)合的可能性，這將允許在縮進(jìn)時(shí)同時(shí)可視化組織結(jié)構(gòu)。因此，可以以無創(chuàng)方式辨別不同組織層的硬度。將來，這可能為我們提供一種重要的臨床工具，以確定面部重建中移植或再生組織的質(zhì)量。