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Piuma生物納米壓痕儀在化學(xué)過程對關(guān)節(jié)軟骨原纖維的療效是滲透壓依賴性

 更新時(shí)間:2022-08-19 點(diǎn)擊量:1265
目的:關(guān)節(jié)軟骨老化被認(rèn)為是骨關(guān)節(jié)炎(OA)的主要危險(xiǎn)因素,其中一部分可以通過晚期糖基化來解釋,該糖基化提供了交聯(lián)(例如戊四烯)在膠原分子內(nèi)的積累。這個(gè)過程導(dǎo)致組織的脆性和潛在的分解。此外,主要是金屬蛋白酶基質(zhì)蛋白(MMPs)的不可逆蛋白水解活性導(dǎo)致膠原纖維裂解,這也導(dǎo)致軟骨分解。以前的研究表明,分子和纖維形式以及角膜的機(jī)械拉伸可以保護(hù)膠原蛋白免受酶裂解。在這項(xiàng)研究中,我們研究了關(guān)節(jié)軟骨的膠原纖維拉伸對膠原酶酶活性以及非酶交聯(lián)活性的影響。
方法:采用兩個(gè)單獨(dú)的馬股骨髁提取相鄰的骨軟骨塞(直徑=8.5 mm)進(jìn)行交聯(lián)(n=5)和酶促(n=6)實(shí)驗(yàn)。解凍后,軟骨層被分成4個(gè)四分之一的圓盤,它們被滲透平衡(400 mOsm / kg水和4°C)約一小時(shí)。應(yīng)用微壓痕(半徑~50 μm和剛度~50 N/m,Piuma,Optics11,荷蘭)獲得1.5*1.5 mm的平均有效楊氏模量2包含 81 個(gè)等間距縮進(jìn)點(diǎn)的區(qū)域。然后將用于酶實(shí)驗(yàn)的圓盤在等離子(400 mOsm / kg水)和高補(bǔ)(4000 mOsm / kg水)條件下進(jìn)行機(jī)械預(yù)處理。此外,用于交聯(lián)實(shí)驗(yàn)的圓盤經(jīng)歷了次強(qiáng)直(100 mOsm / kg水)條件。此后,將酶促樣品在37oC下在II型膠原酶(0.5μM,Worthington生化公司)中孵育1小時(shí),其相應(yīng)的滲透壓具有足夠的Ca供應(yīng)。處理后,將樣品重新平衡(400 mOsm / kg水和4°C)1小時(shí),并在與初始步驟相同的區(qū)域進(jìn)行微壓痕。平均有效楊氏模量的相對差異被用作產(chǎn)生膠原裂解并降低剛度的化學(xué)活性的指示(膠原酶II型)或產(chǎn)生交聯(lián)和增加的剛度(L-threose)。此外,在L-threose中孵育后樣品的表面顏色被量化為非酶交聯(lián)效率的指示。++
結(jié)果:在高滲透壓條件下,用膠原酶II型處理的樣品的平均有效楊氏模量損失較低(圖1)。在所有組中,我們觀察到交聯(lián)過程的滲透壓依賴性趨勢(圖2)。滲透壓的增加與膠原纖維交聯(lián)的更高機(jī)會有關(guān),如平均有效楊氏模量的變化所表明的那樣。此外,軟骨表面的顏色分析證實(shí)了隨著滲透壓的增加,交聯(lián)的增加,即向深黃色發(fā)展(圖3)。

結(jié)論:化學(xué)反應(yīng)被認(rèn)為是關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)幾種類型的膠原纖維改變的原因,即OA中發(fā)生的酶裂解和衰老中發(fā)生的晚期糖化或非酶交聯(lián)。減少這些糖基化反應(yīng)的一種方法是增強(qiáng)膠原纖維中的前應(yīng)力,這可以通過外部浴中的低滲透壓或增加蛋白聚糖含量來實(shí)現(xiàn)。在目前的研究中,我們表明膠原纖維預(yù)應(yīng)力在控制細(xì)菌膠原酶誘導(dǎo)的降解方面也起作用,盡管與糖基化過程相比,這是相反的。然而,滲透壓(即膠原纖維預(yù)應(yīng)力)對MMPs酶活性的影響尚未作為本研究的補(bǔ)充進(jìn)行研究。因此,宏觀尺度上的機(jī)械力可以極大地影響關(guān)節(jié)軟骨中膠原纖維內(nèi)的分子過程,這可能提供潛在的策略來限制它們,從而延長關(guān)節(jié)軟骨的功能壽命。

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