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Optics11公司PIUMA納米壓痕在水凝膠中的應(yīng)用

 更新時(shí)間:2022-11-28 點(diǎn)擊量:1146

題目:人心房成纖維細(xì)胞對(duì)基質(zhì)剛度異質(zhì)性的適應(yīng)

(如果需要完整文獻(xiàn)請(qǐng)與我們工作人員聯(lián)系,可試樣)

摘要:纖維化與衰老和許多心臟病有關(guān)。其特征在于肌成纖維細(xì)胞分化和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的過(guò)度積累。纖維化相關(guān)的組織重塑導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)和功能的顯著變化,包括被動(dòng)機(jī)械性能。隨著最近開(kāi)發(fā)的新工具和方法,該研究領(lǐng)域獲得了顯著的發(fā)展,以更好地表征和理解細(xì)胞感知和響應(yīng)其生物物理環(huán)境的能力。我們使用一種稱為CyPhyGel的新型水凝膠來(lái)提供與重塑相關(guān)的組織硬度變化的*體外模型?;谒{(lán)藻光敏色素的光控二聚化,它能夠以高空間和時(shí)間分辨率對(duì)水凝膠機(jī)械性能進(jìn)行非接觸式和可逆調(diào)諧。在CyPhyGels上培養(yǎng)人原代心房成纖維細(xì)胞。在硬質(zhì)(~4.6 kPa)或軟質(zhì)(~2.7 kPa)CyPhyGels上培養(yǎng)4天后,我們分析了成纖維細(xì)胞面積和硬度。與在較硬的基質(zhì)上生長(zhǎng)的細(xì)胞相比,在較軟的基質(zhì)上生長(zhǎng)的細(xì)胞更小更軟。當(dāng)軟質(zhì)和硬質(zhì)生長(zhǎng)底物組合在單個(gè)CyPhyGel中時(shí),不存在這種差異,產(chǎn)生的細(xì)胞面積與均質(zhì)剛性凝膠上的細(xì)胞面積相似,細(xì)胞剛度與均質(zhì)軟基質(zhì)上的細(xì)胞剛度相似。使用CyPhyGels在體外模擬組織硬度異質(zhì)性,我們的結(jié)果證實(shí)了心臟成纖維細(xì)胞適應(yīng)其機(jī)械環(huán)境的能力,并表明存在一種旁分泌機(jī)制,該機(jī)制可以調(diào)整與機(jī)械誘導(dǎo)的表型向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化相關(guān)的成纖維細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能特性。在局部組織硬度增加的情況下,例如在瘢痕形成或彌漫性纖維化時(shí),這種機(jī)制可以幫助防止正常組織和患病組織之間邊界區(qū)域的細(xì)胞特性突然變化。CyPhyGeles的光可調(diào)機(jī)械性能及其對(duì)研究人類原代心臟細(xì)胞的適用性使其成為心臟力學(xué)生物學(xué)研究的有吸引力的模型系統(tǒng)。進(jìn)一步的研究將探索生物物理和可溶性因素在心臟成纖維細(xì)胞對(duì)空間和時(shí)間異質(zhì)機(jī)械線索的反應(yīng)中的相互作用。

一、介紹

由于衰老、機(jī)械超負(fù)荷或損傷等原因引起的心臟組織損傷與纖維化的發(fā)展有關(guān)。纖維化的特征在于肌成纖維細(xì)胞分化和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白的過(guò)度積累(Herum等人,2017)。這種重塑主要是由成纖維細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的(Manabe等人,2002;Travers等人,2016),組織結(jié)構(gòu)和力學(xué)的變化,其后果從心輸出量受損到心律失常脆弱性增加(Nguyen和Qu,2014)。最終,纖維化的存在和程度是心臟性猝死的主要危險(xiǎn)因素(Disertori等人,2016)。到目前為止,還沒(méi)有有效的治療方法來(lái)逆轉(zhuǎn)心臟纖維化,主要是由于對(duì)潛在的基本機(jī)制了解不足。

可能的治療方法必須考慮組織力學(xué)的變化,這既是重塑的原因,也是重塑的結(jié)果。成纖維細(xì)胞對(duì)其機(jī)械環(huán)境的感知已被證明在纖維化重塑中發(fā)揮作用(Hinz,2013;范普滕等人,2016 年)。近年來(lái),已經(jīng)開(kāi)發(fā)了幾種體外模型來(lái)研究成纖維細(xì)胞機(jī)械傳感。這些模型中的主要一類使用合成基材,包括水凝膠和有機(jī)硅。這些允許研究人員規(guī)定培養(yǎng)細(xì)胞的機(jī)械環(huán)境(Rosales和Kristi,2016;李等人,2018)?;蛘?,天然存在的底物,如脫細(xì)胞組織(Ott等人,2008)或活的心臟組織切片(Perbellini等人,2018)已被用于為細(xì)胞提供近生理生長(zhǎng)底物,但這些是更復(fù)雜且可重復(fù)性較差的模型。更接近地模擬體內(nèi)條件的底物是的,因?yàn)楫?dāng)ECM生產(chǎn)克服退化時(shí),纖維化組織的整體剛度提高(Levental等人,2010),剛度分布是高度異質(zhì)的。具有或多或少ECM的區(qū)域構(gòu)成了不同的機(jī)械微域。在彌漫性纖維化中,例如在心房顫動(dòng)中,僵硬的ECM島分布在較軟的組織中(Tanaka等人,2007)。鑒于對(duì)單細(xì)胞的機(jī)械效應(yīng)主要由其微環(huán)境主導(dǎo),體外模型應(yīng)復(fù)制這些剛度異質(zhì)性,理想情況下以可控的方式。

允許在機(jī)械性能中引入空間梯度的模型已被用于證明成纖維細(xì)胞的剛度引導(dǎo)遷移,這一過(guò)程稱為durotaxis,取決于基質(zhì)蛋白的類型(Hartman等人,2017)。此外,具有微圖案剛性和軟區(qū)域的水凝膠用于顯示細(xì)胞在各種剛度上的適應(yīng)性(Sunyer等人,2012),并研究基質(zhì)組織對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的作用(Yang等人,2016)。然而,這些模型不允許人們?cè)跁r(shí)間或空間上動(dòng)態(tài)和可逆地改變生長(zhǎng)基質(zhì)的被動(dòng)機(jī)械性能。基于藍(lán)藻光敏色素Cph1的新型水凝膠系統(tǒng)(我們?cè)谶@里稱為CyPhyGel)可以通過(guò)允許水凝膠硬度的光控,可逆變化來(lái)解決這一限制(H?rner等人,2019b)。為此,使用細(xì)胞兼容的紅光在其單體(740nm)或二聚體(660nm)形式之間切換Cph1,從而分別以非接觸方式減少或增加生長(zhǎng)基質(zhì)中的交聯(lián)數(shù)量。CyPhyGels的剛度可以在1.5和5.5 kPa(有效楊氏模量)之間變化。剛度的變化發(fā)生在照明的幾秒鐘內(nèi),是可分級(jí)的,在沒(méi)有光線的情況下是穩(wěn)定的,并且是可逆的(H?rner等人,2019b)。在這項(xiàng)研究中,我們使用CyPhyGels來(lái)研究人類心臟成纖維細(xì)胞對(duì)杜羅抗性以外機(jī)械環(huán)境剛度異質(zhì)性的適應(yīng)。

二、材料和方法

CyPhyGels和成纖維細(xì)胞的納米壓痕

有效楊氏模量,E伊芙,使用Chiaro納米壓痕系統(tǒng)(Optics11,荷蘭阿姆斯特丹)進(jìn)行評(píng)估。連接到校準(zhǔn)懸臂上的球形用于壓痕樣品,同時(shí)將激光束照射到反射懸臂表面上。對(duì)反射的激光進(jìn)行干涉分析,以測(cè)量與懸臂彎曲相關(guān)的相移。由此計(jì)算出樣品壓痕所需的力。E伊芙使用接觸力學(xué)的赫茲模型推導(dǎo)(赫茲,1881;陳,2014)假設(shè)不可壓縮材料的泊松比為0.5,通常用于細(xì)胞和組織的機(jī)械測(cè)試(圖1B;Guz 等人,2014 年)。在整份手稿中,E伊芙稱為剛度。以5 μm/s的置換速度進(jìn)行2–4 μm的樣品壓痕。數(shù)據(jù)分析使用 Optics11 DataViewer (V2.0.27)。

Chiaro人體組織和軟材料的機(jī)械性能-杭州軒轅科技有限公司

對(duì)于CyPhyGel表征,使用了彈簧常數(shù)為0.45–0.5 N/m且半徑為20–23 μm的懸臂。對(duì)于細(xì)胞評(píng)估,使用彈簧常數(shù)為0.01-0.02 N/m的懸臂和半徑為3-3.5μm的。通過(guò)在兩到三個(gè)與細(xì)胞核不重疊的不同位置進(jìn)行表面法向壓痕來(lái)確定單個(gè)細(xì)胞的剛度。對(duì)于每個(gè)壓痕,使用赫茲模型來(lái)擬合從初始細(xì)胞表面接觸到1μm壓痕的力 - 位移曲線,以避免來(lái)自底層生長(zhǎng)基質(zhì)的機(jī)械干擾。在接種CyPhyGels后4天評(píng)估細(xì)胞硬度。

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結(jié)果

通過(guò)光調(diào)節(jié)CyPhyGels的機(jī)械性能

均勻暴露在660 nm照明下的CyPhyGels具有E伊芙4.59 ± 0.11 kPa,而用 740 nm 照明后,E伊芙分別為 2.72 ± 0.06 kPa(圖 2A,)。相似的最大值和最小值 E伊芙發(fā)現(xiàn)了異質(zhì)CyPhyGels的兩個(gè)差異調(diào)諧的一半。為了對(duì)剛度梯度進(jìn)行空間表征,以50μm的步長(zhǎng)繪制了異質(zhì)CyPhyGels,沿著垂直于其剛性和軟性兩半之間邊界的線繪制。E伊芙從 4.48 ± 0.58 變?yōu)?2.12 ± 0.30 kPa(圖 2C)。在邊界附近使用更高分辨率的步長(zhǎng)(5μm),我們發(fā)現(xiàn)剛性和軟區(qū)域之間的過(guò)渡發(fā)生在100-150μm的寬帶內(nèi)(圖2D)。邊界區(qū)域的寬度至少在1毫米以上是恒定的(補(bǔ)充圖S3)。

圖2




圖2.CyPhyGels的機(jī)械性能。(A)本實(shí)驗(yàn)中使用的CyPhyGel配置的示意圖。(二)E伊芙的CyPhyGels,暴露于660或740nm(n = 24)的均勻照明或順序照明,因此機(jī)械異質(zhì)(n = 4),通過(guò)納米壓痕測(cè)定。(三) E伊芙沿著垂直于三個(gè)代表性異質(zhì)CyPhyGels的剛性和軟性兩半之間邊界的軸,說(shuō)明了凝膠剛度的階躍變化(連續(xù)測(cè)量點(diǎn)之間的距離為50μm,n = 3)。(D)從圖C對(duì)凝膠3中的過(guò)渡區(qū)域進(jìn)行更高分辨率的評(píng)估(測(cè)量點(diǎn)之間的距離為5μm)。(E) E伊芙在照明后(第0天)和6天后立即從圖C獲得凝膠3,對(duì)應(yīng)于實(shí)驗(yàn)的持續(xù)時(shí)間。


為了評(píng)估CyPhyGel剛度的異質(zhì)性是否隨時(shí)間推移而持續(xù),在順序照明后6天測(cè)量了剛度,這對(duì)應(yīng)于實(shí)驗(yàn)的持續(xù)時(shí)間。具有不同剛度的兩個(gè)區(qū)域仍然清晰可辨(圖2E)。6天內(nèi)柔軟區(qū)域的硬度略有增加是由于在CyPhyGel處理和細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中暴露于外部光線(補(bǔ)充圖S2)。

結(jié)論

我們提出了一種新的體外模型,適用于研究對(duì)基質(zhì)剛度局部和時(shí)間變化的動(dòng)態(tài)生物學(xué)反應(yīng)。該模型將用于闡明不同機(jī)械微環(huán)境中細(xì)胞之間的通信機(jī)制,例如模擬纖維化或瘢痕性心肌。我們的結(jié)果表明,心臟成纖維細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)基質(zhì)機(jī)械特性的適應(yīng)可以通過(guò)旁分泌因子以及直接的細(xì)胞 - 細(xì)胞接觸來(lái)調(diào)節(jié)。

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生物組織納米壓痕儀介紹
Piuma納米壓痕儀的核心部件是其安裝在壓痕移動(dòng)平臺(tái)上極其敏銳的壓痕探頭
1.壓痕移動(dòng)平臺(tái),具備粗進(jìn)以及精進(jìn)兩級(jí)移動(dòng)精度,使得探針可以自動(dòng)尋找到表面并且提供高精度壓痕。除了壓痕移動(dòng)平臺(tái),Piuma納米壓痕儀還有一個(gè)手動(dòng)樣品移動(dòng)平臺(tái)
2.方便樣品的安放。你的樣品可以放在X-Y移動(dòng)臺(tái)上Piuma Nanoindenter微納壓痕儀廠商

3.進(jìn)行楊氏模量的測(cè)試或者進(jìn)行多點(diǎn)陣測(cè)試。一個(gè)內(nèi)置式的顯微鏡
4.可以直接觀察實(shí)驗(yàn)過(guò)程!Piuma Nanoindenter微納壓痕儀廠商

 

生物組織納米壓痕儀是一個(gè)簡(jiǎn)單易用的革命性產(chǎn)品,為軟物質(zhì)以及生物材料組織的微觀以及納觀研究帶來(lái)希望。依靠自身*的新型光學(xué)技術(shù)以及杰出的微加工工藝,Piuma納米壓痕儀可以測(cè)量楊氏模量軟的樣品,范圍甚至是從5Pa到5GPa!Piuma同樣非常適合在液體中測(cè)試樣品。其操作非常簡(jiǎn)單易學(xué),只需將探頭插入儀器中,簡(jiǎn)單定標(biāo)后,即可馬上開(kāi)始?jí)汉蹖?shí)驗(yàn)。

產(chǎn)品構(gòu)件詳細(xì)介紹
1.PROBE探頭
納米壓痕儀核心:一個(gè)微加工工藝制作的光學(xué)壓痕探頭
2.SAMPLE樣品
從水凝膠到骨組織等,在大氣中或者浸沒(méi)在液體中
3.SAMPLEXYSTAGEXY樣品臺(tái)
在X-Y(12x12mm)范圍內(nèi)測(cè)試樣品
4.INDENTATIONSTAGE壓痕移動(dòng)臺(tái)
粗進(jìn)以及精進(jìn)移動(dòng)臺(tái)實(shí)現(xiàn)精確壓痕以及自動(dòng)尋找樣品表面
5.MANUALSTAGE手動(dòng)平臺(tái)
為任何樣品以及容器創(chuàng)造空間

 

納米以及微米級(jí)別的生物機(jī)械性能

Piuma是一個(gè)創(chuàng)新的,具有成本效益的工具,用來(lái)表征生物材料、組織、細(xì)胞器、細(xì)胞層、軟骨、靜電支架、力學(xué)性能,3D打印材料,水凝膠等的微納米機(jī)械性能。

The Piuma 納米壓痕儀專為迎合生物材料以及組織研究人員和工程師的需求,提供易用性和便攜性,同時(shí)提供高精度、高通量和多樣化的數(shù)據(jù)。Optics11小型化的玻璃探針式壓頭,特別適合在液體中測(cè)量水合樣品。組織工程和再生醫(yī)學(xué)的研究者,Piuma納米壓痕儀是衡量他們感興趣材料剛度的一個(gè)解決方案。 

 biologicalsample 

軟物質(zhì)材料表征

在生物材料、組織工程、再生醫(yī)學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域,Piuma可以在溶液里進(jìn)行非破壞性測(cè)量測(cè)量某點(diǎn)或者某個(gè)區(qū)域的楊氏模量、蠕變和松弛實(shí)驗(yàn),點(diǎn)陣測(cè)量粘附力,描述應(yīng)變硬化行為,樣品的粘度等。測(cè)試生物材料和組織樣本的軟硬度可以很容易地在Piuma納米壓痕儀上用其optics11 PIUMA探頭和專用的Piuma軟件來(lái)實(shí)現(xiàn)。 

Piuma Nanoindenter是荷蘭Optics11公司出品的新型生物納米壓痕儀。主要應(yīng)用范圍為生物組織、生物支架、水凝膠、聚合物、細(xì)胞等軟物質(zhì)以及生物材料的機(jī)械性能研究。采用了新型探頭設(shè)計(jì),彌補(bǔ)了傳統(tǒng)其他納米壓痕儀無(wú)法測(cè)試軟物質(zhì)的問(wèn)題也解決了原子力顯微鏡在軟物質(zhì)測(cè)試中的數(shù)據(jù)波動(dòng)大,操作困難、制樣嚴(yán)苛等常見(jiàn)問(wèn)題。更開(kāi)創(chuàng)性的在壓痕儀中加入了動(dòng)態(tài)力學(xué)測(cè)試模式DMA,可以獲得材料與振動(dòng)頻率相關(guān)的儲(chǔ)存模量、損失模量和損失因子,用于研究材料在交變力作用下的滯后現(xiàn)象和力學(xué)損耗。


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